正確評價藥品檢驗中的不確定度是藥物分析中的一個難點，有人對HPLC測定咖啡因的不確定度進行了研究，但尚未見關(guān)于抗生素微生物檢定法測定中含量不確定度的報道。本文以阿奇霉素標準品的含量標定為例，對抗生素微生物檢定法中的不確定度計算進行探討研究，以提高數(shù)據(jù)分析和測定結(jié)果的準確性和可信度。    

　　一、實驗部分

　　1.儀器與試劑
　　ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)；BP-211D分析天平(瑞士Sartorius公司)；電熱隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；阿奇霉素標準品(中國藥品生物制品檢定所，效價測定用，946μ/mg，批號:130352-200304)與阿奇霉素供試品(中國藥品生物制品檢定所)；Ⅰ號7.8～8.0培養(yǎng)基(批號—040212，北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)、中國藥品生物制品檢定所監(jiān)制)；短小芽孢桿菌〔CMCC(B)63 202〕(中國藥品生物制品檢定所)；磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀等試劑均為分析純；水為去離子純化水。

　　2.標準品溶液與供試品溶液的制備
　　(1)標準品溶液的制備:精密稱取阿奇霉素標準品0.05285g，加乙醇28mL使之溶解，再加滅菌水定量稀釋至50mL，搖勻，得溶液為1000μ/mL。精密吸取該溶液(1000μ/mL)5.0mL，用磷酸鹽緩沖液(pH7.8)稀釋至50mL，搖勻，得溶液為100μ/mL；再分別精密吸取溶液(100μ/mL)5.0mL，分別用磷酸鹽緩沖液(pH7.8)稀釋至50mL與100mL，搖勻，得溶液分別為10μ/mL與5μ/mL，作為標準品溶液的高、低劑量。

　　(2)供試品溶液的制備:精密稱取阿奇霉素供試品0.05260g(估計效價950.6μ/mg)，溶解與稀釋同標準品溶液的制備，得溶液分別為10μ/mL與5μ/mL，作為供試品溶液的高、低劑量。

　　3.雙碟的制備與培養(yǎng)
　　取平底雙碟約10套(n)，分別加入加熱融化的培養(yǎng)基20mL，放置水平臺上使凝固，作為底層。另取加熱融化后的培養(yǎng)基適量，放冷至50℃，加入短小芽孢桿菌的菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5mL，攤布均勻，作為菌層。冷卻后，在每一雙碟中以等距離安置不銹鋼小管4(k)個，待用。將上述稀釋好的標準品溶液與供試品溶液分別滴加于不銹鋼小管內(nèi)，在(35～37)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16～18)小時。

　　4.抑菌圈直徑的測定與效價計算
　　取出培養(yǎng)好的雙碟，用抑菌圈測量儀測量各個抑菌圈的直徑，照生物檢定統(tǒng)計法(中國藥典2005年版二部附錄XI V中的2.2法)進行可靠性檢驗與效價計算。當(dāng)可靠性檢驗結(jié)果為回歸非常顯著(P<0.01)與偏離平行不顯著(P>0.05)時，實驗結(jié)果才成立。    

　　二、結(jié)果與討論

　　1.數(shù)學(xué)模型
　　被測量是供試品的效價，它取決于標準品的質(zhì)量、純度與供試品的質(zhì)量、標準品溶液產(chǎn)生的直徑、供試品溶液產(chǎn)生的直徑。抑菌圈直徑測定時，分別對10個雙碟進行掃描測定，測定結(jié)果見表1。
    

表1  抑菌圈測量的直徑值(d)

　　效價由下式給出:
    

　　式中，ms與</i></HTML>mt</i></HTML>分別為標準品與供試品的質(zhì)量，5mL為移液管的體積，50mL與100mL均為容量瓶的體積。常數(shù)0.3010，由濃度間的比率決定，與所用雙碟數(shù)無關(guān)，因此，劑距為2∶1不變時，增加雙碟數(shù)，常數(shù)0.3010仍不變。S₂為n個雙碟高濃度標準品溶液所制的抑菌圈直徑值的總和，S₁為n個雙碟低濃度標準品溶液所制的抑菌圈直徑值的總和；T₂為n個雙碟高濃度供試品溶液所制的抑菌圈直徑值的總和，T₁為n個雙碟低濃度供試品溶液所制的抑菌圈直徑值的總和。

　　除抑菌圈直徑值引起的輸入量的標準不確定度外，不確定度還包括標準品和供試品的稱重、標準品純度、容量瓶體積、移液管體積、抑菌圈測量儀等。這個合成的不確定度即為效價測定的不確定度。

　　2.各分量的標準不確定度
　　(1)抑菌圈直徑值的不確定度分量u(x₁)
　　對抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，根據(jù)上述公式計算效價(y)為934.2μ/mg，同時統(tǒng)計分析得自由度f=(k-1)(n-1)=27，其合并樣本標準差即標準不確定度為:
    

　　相對標準不確定度為:
　　u(x₁)_rel=u(x₁)/y=0.159/934.24=1.70×10^-4

　　(2)抑菌圈測量儀的不確定度分量u(x₂)
    

　　抑菌圈測量儀的最大允許誤差為±0.02mm，則區(qū)間半寬度aP=0.02mm，測量值落在該區(qū)間的概率分布為均勻分布，包含因子，其標準不確定度為:
　　移菌圈測量儀的標準圈直徑為19mm，其相對標準不確定度為:
    

　　(3)配制溶液的不確定度分量u(x₃)
　?、贅藴势啡芤旱牟淮_定度u_s(x₃)
　　a.定容體積V的標準不確定度u_v，A級100.00mL單標線容量瓶的容量誤差允許±0.1mL，按三角分布考慮，取，則標準不確定度，相對標準不確定度為0.04/100=0.0004。

　　用A類方法評定，即通過對容量瓶的重復(fù)實驗可以估算定容變動產(chǎn)生的不確定度。液體的體積與其比重的乘積等于其重量，同一液體的比重為常數(shù)，因此可以對典型的100mL容量瓶定容10次，并稱量求取其標準偏差來評價其容量配置的重復(fù)性。采用貝塞爾方法計算標準偏差，標準不確定度等于1倍標準偏差，用A級100.00mL容量瓶配制溶液，稀釋至刻度線的度數(shù)，重復(fù)性引起的不確定度為0.04mL。配置溶液時，水溫接近20℃，因而溫度的影響可忽略不計，則定容體積V的標準不確定度為:，相對標準不確定度為:u_v1rel=0.06/100.00=0.0006。
　　同樣地，50.00mL容量瓶的標準不確定度與相對標準不確定度分別為:u_v2=0.05mL與u_v2rel=0.0005。
　　使用100.00mL容量瓶1次與50.00mL容量瓶3次，因此定容體積的合成標準不確定度為:
    

　　b.移取溶液的不確定度分量u_νyrel
　　考慮到移取溶液體積量，認為移取溶液的不確定度來自于移液管刻度的不確定度，根據(jù)規(guī)定，5mL移液管的最大允許誤差為±0.015mL，按三角分布考慮，取，則。

　　用A類方法評定，重復(fù)性引起的不確定度為0.008mL。配置溶液時，水溫接近20℃，因而溫度的影響可忽略不計，使用移液管2次，則移取溶液的標準不確定度為:，相對標準不確定度為:。
    c.標準品純度引起的不確定度u_mc
    阿奇霉素標準品含量的標準不確定度為1%，取，則
    d.標準品質(zhì)量的標準不確定度u_m
    天平使用說明書給出的天平的分辨力為0.01mg，包含因子，則天平的不確定度
    天平使用說明書給出的天平的重復(fù)性誤差為0.02mg，認為服從矩形分布，包含因子，則稱量重復(fù)性不確定度
    標準品質(zhì)量的相對標準不確定度
    合成標準品溶液的不確定度u_s(x₃)
    

    ②供試品溶液的不確定度u_T(x₃)
    同樣計算:
    a.定容體積V的標準不確定度u_vrel
    

    b.移取溶液的不確定度分量u_νyrel
    

    c.供試品質(zhì)量的標準不確定度u_m
    供試品質(zhì)量的相對標準不確定度u_mrel
    

    合成供試品溶液的不確定度u_T(x₃)
    

    因而配制溶液的不確定度
    

　　3.總合成標準不確定度u(y)
　　合成標準不確定度由抑菌圈直徑值觀測列的不確定度即A類不確定度u(x₁)與B類不確定度即移菌圈測量儀的標準不確定度u(x₂)、配置溶液的不確定度u(x₃)組成，它們是各自獨立的分量，因而可按方和根方式進行合成標準不確定度的計算:    

　　4.擴展不確定度
　　實驗結(jié)果一般用擴展不確定度表示。u(y)/y=0.0030，y=934.24μ/mg，u(y)=0.0030×934.24μ/mg=2.80μ/mg。取包含因子k=2(置信概率約為95%)，則擴展不確定度為U=2u(y)=2×2.80μ/mg=5.6μ/mg。阿奇霉素效價測定的結(jié)果可表示為:(934.2±5.6)μ/mg(k=2)。    

　　三、總結(jié)

　　不同參數(shù)對效價測定不確定度的貢獻不同，標準品質(zhì)量與供試品質(zhì)量對不確定度的貢獻最大；其次為移液管體積不確定度與容量瓶體積不確定度；標準品純度的不確定度、抑菌圈直徑值的不確定度及抑菌圈測量儀不確定度實際上對總不確定度沒有影響。

　　根據(jù)效價測定的特點，其操作方法可分為供試品和標準品的稱量、供試品和標準品溶液的制備、雙碟的制備與培養(yǎng)、抑菌圈直徑值的測量與效價計算等步驟，因此，在計算時，應(yīng)先分別計算各過程的不確定度，再計算合成相對不確定度，這樣方便理解和計算。
　　作者單位【河南省藥品檢驗所】