上圖顯示了一個(gè)間距為5000 nm±1nm的孔徑陣列?？资构獯┻^(guò)載玻片上的金屬膜。利用光學(xué)顯微鏡對(duì)孔徑陣列成像會(huì)導(dǎo)致孔徑間距出現(xiàn)明顯誤差。了解真實(shí)間距可以校正這些成像誤差。這個(gè)校準(zhǔn)過(guò)程可以準(zhǔn)確測(cè)量大圖像上的位置。Credit: NIST

在過(guò)去的二十年里，科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡可以用來(lái)探測(cè)、跟蹤和成像比傳統(tǒng)極限小得多的物體——大約是可見(jiàn)光波長(zhǎng)的一半，或者幾百納米。

這項(xiàng)具有開(kāi)創(chuàng)性的研究獲得了2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，它使研究人員能夠追蹤受精卵中的蛋白質(zhì)，觀察分子如何形成大腦神經(jīng)細(xì)胞之間的電連接，并研究微型發(fā)動(dòng)機(jī)的納米級(jí)運(yùn)動(dòng)。

現(xiàn)在，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）的研究進(jìn)展使顯微鏡能夠以更高的準(zhǔn)確度測(cè)量這些納米級(jí)的細(xì)節(jié)。

“我們把光學(xué)顯微鏡再放到一個(gè)顯微鏡下，以達(dá)到接近原子級(jí)的準(zhǔn)確度，”NIST的項(xiàng)目負(fù)責(zé)人Samuel Stavis說(shuō)。

由于光學(xué)顯微鏡傳統(tǒng)上沒(méi)有被用于納米范疇的研究，因此，它們通常也不進(jìn)行納米級(jí)準(zhǔn)確度所必需的校準(zhǔn)，即與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較以檢驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確。顯微鏡可能是精確的，可以始終如一地指示出單個(gè)分子或納米顆粒的相同位置。然而，與此同時(shí)，它也可能是極其不準(zhǔn)確的——由于無(wú)法解釋的誤差，本應(yīng)能識(shí)別十億分之一米范圍內(nèi)的顯微鏡對(duì)物體位置的識(shí)別實(shí)際上可能是百萬(wàn)分之一米。NIST這項(xiàng)研究的合著者Jon Geist說(shuō)：“只有精度而沒(méi)有準(zhǔn)度是非常誤導(dǎo)人的。”

為了解決這個(gè)問(wèn)題，NIST開(kāi)發(fā)了一種新的校準(zhǔn)方法，可以仔細(xì)檢查和糾正這些成像錯(cuò)誤。這一方法使用的參考物質(zhì)（具有眾所周知的穩(wěn)定特性的物體）具有大規(guī)模生產(chǎn)的潛力，并可廣泛分布到各個(gè)實(shí)驗(yàn)室。

這一點(diǎn)很重要，因?yàn)楣鈱W(xué)顯微鏡是常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室儀器，可以很容易地放大各類不同的樣品，從精細(xì)的生物樣品到電子和機(jī)械設(shè)備。此外，隨著光學(xué)顯微鏡在智能手機(jī)中加入了科學(xué)版的照明光和攝像頭后，它們的功能變得越來(lái)越強(qiáng)大，也越來(lái)越經(jīng)濟(jì)。

NIST團(tuán)隊(duì)依靠納米級(jí)制造工藝來(lái)開(kāi)發(fā)這種參考物質(zhì)。研究人員使用電子束和離子銑削技術(shù)，在玻璃載玻片上穿過(guò)鉑薄膜形成針孔小孔陣列。這一過(guò)程使研究小組能夠?qū)⒖讖介g隔控制在5000納米，準(zhǔn)確度為1納米左右。通過(guò)這種方式，研究人員在光圈位置上建立了一個(gè)準(zhǔn)確度測(cè)量系統(tǒng)。

穿過(guò)孔徑陣列發(fā)出的光產(chǎn)生了一系列成像點(diǎn)。但是由于所有顯微鏡鏡頭都有瑕疵，因此在成像過(guò)程中不可避免地會(huì)造成誤差，這些誤差會(huì)改變點(diǎn)的視在位置，從而使光圈之間的間距看起來(lái)大于或小于團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的實(shí)際間距。知道真實(shí)的間距可以校正成像誤差，并可以校準(zhǔn)顯微鏡，從而可以在一個(gè)寬泛的視野中高準(zhǔn)度地測(cè)量位置。

即使是一個(gè)小錯(cuò)誤也會(huì)導(dǎo)致大問(wèn)題。以顯微鏡為例，當(dāng)制造商指定的預(yù)期放大倍數(shù)為100倍時(shí)，顯微鏡的實(shí)際放大倍數(shù)為103倍，在顯微鏡下成像時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生3%的誤差。由于透鏡的缺陷，一個(gè)更微妙的問(wèn)題也出現(xiàn)了——顯微鏡的放大率改變了圖像，導(dǎo)致圖像失真。為了解決這個(gè)問(wèn)題，NIST團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了可在大視野范圍內(nèi)工作的孔徑陣列和校準(zhǔn)過(guò)程。

這種孔徑陣列可使單個(gè)研究人員能夠在自己的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行校準(zhǔn)，它將使光學(xué)顯微鏡準(zhǔn)確定位單個(gè)分子和納米顆粒位置的能力提高1萬(wàn)倍。

Stavis和他的同事們，包括來(lái)自NIST和馬里蘭大學(xué)的馬里蘭納米中心的第一作者Craig Copeland，已將其研究成果發(fā)表于期刊Light: Science & Applications（《光：科學(xué)與應(yīng)用》）。

“我們確定并解決了一個(gè)未被充分認(rèn)識(shí)的問(wèn)題，”Copeland說(shuō)道。

在用這種陣列校準(zhǔn)了光學(xué)顯微鏡后，研究小組又反過(guò)來(lái)使用他們的光學(xué)顯微鏡來(lái)識(shí)別納米制造過(guò)程中的原型陣列缺陷。“為了控制孔徑間距，我們測(cè)試了納米制造的極限，”NIST納米制造的管理人及合著者Rob Ilic說(shuō)。光學(xué)顯微鏡的簡(jiǎn)便性和快速性可在生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)孔徑陣列的質(zhì)量進(jìn)行控制。

最后，研究小組利用孔徑陣列的固有穩(wěn)定性來(lái)評(píng)估熒光納米顆粒（通常在光學(xué)顯微鏡中用作固定參考點(diǎn)）到底是固定在一個(gè)特定的點(diǎn)上，還是在四處移動(dòng)。研究人員發(fā)現(xiàn)，雖然光學(xué)顯微鏡無(wú)意的運(yùn)動(dòng)使納米顆粒的圖像變得模糊，但孔徑陣列顯示納米顆粒實(shí)際上并沒(méi)有出現(xiàn)原子級(jí)移動(dòng)。