衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心　汪靜  郭健  陳文祥  謝潔紅  張傳寶  馬嶸  趙海艦

本文為“第一屆《中國(guó)計(jì)量》中青年優(yōu)秀科技論文獎(jiǎng)”三等獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)文章之一

　　酶學(xué)測(cè)定是臨床檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目，其測(cè)定結(jié)果的不確定度評(píng)估目前在國(guó)內(nèi)尚未開(kāi)始。但國(guó)內(nèi)酶學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)已略具雛形，其主要功用之一是為酶參考物質(zhì)賦值，無(wú)論是國(guó)際還是國(guó)內(nèi)均要求在給出參考物最佳期望值的同時(shí)給出該值的不確定度，因此，如何評(píng)估酶學(xué)參考方法測(cè)定結(jié)果的不確定度就成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。我們通過(guò)詳細(xì)分析在本實(shí)驗(yàn)室條件下運(yùn)行國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)參考測(cè)定方法的全部過(guò)程，參照J(rèn)JF1059-1999《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》、JJF1135-2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》、CNAS-GL06《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》，對(duì)測(cè)定結(jié)果的不確定度進(jìn)行試評(píng)估，希望能建立一種較為科學(xué)合理的酶學(xué)參考方法測(cè)定結(jié)果不確定度的評(píng)估模式。    

　　一、材料與方法

　　1.樣品
　　凍干人血清，復(fù)溶體積5mL，在-20℃下保存。復(fù)溶采用稱重法，記錄兩次稱重?cái)?shù)據(jù)及水溫，查《1990年國(guó)際溫標(biāo)純水密度表》換算出實(shí)際復(fù)溶體積。

　　2.試劑
　　乳酸脫氫酶(LDH)購(gòu)自ROCHE公司，其余試劑購(gòu)自SIGMA公司。按照IFCC 37℃ ALT參考測(cè)定方法中的試劑配方進(jìn)行試劑配制，所用天平為 級(jí)(特種準(zhǔn)確度級(jí))，pH計(jì)為0.1級(jí)(示值誤差≤|±0.01|)，容量瓶為A級(jí)，溫度計(jì)準(zhǔn)確度為±0.02℃，所有稱量步驟的擴(kuò)展不確定度(k=2)均小于1.5%。

　　3.儀器
　　HITACHI U3000可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)及配套比色皿溫度控制附件，D642高精度溫度計(jì)，THERMO 520A pH計(jì)，METTLER AE163電子天平，EPPENDORF移液器，HAMILTON稀釋分配器。

　　4.測(cè)定方法
　　測(cè)定原理為樣品(200μL)中的ALT催化反應(yīng)試劑(2000μL)中的L-丙氨酸與啟動(dòng)試劑(200μL)中的α-酮戊二酸，使之轉(zhuǎn)化為丙酮酸與L-谷氨酸，新生成的丙酮酸在反應(yīng)試劑中的LDH的催化下，被NADH還原為乳酸，NADH同時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD+，由于NADH在340nm處有最大吸收，此時(shí)測(cè)定340nm下NADH吸光度的下降速率即代表樣品中ALT的活性濃度。本次實(shí)驗(yàn)在1天內(nèi)完成，重復(fù)測(cè)定樣品10次，試劑空白測(cè)定2次。將測(cè)定結(jié)果記錄后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。    

　　二、測(cè)量不確定度評(píng)定的結(jié)果與討論

　　1.測(cè)定結(jié)果中不確定度來(lái)源分析
　　樣品中ALT活性濃度C由下式確定:
    
    設(shè):，則式(1)變?yōu)?br />     
    式中:C——樣品中ALT活性濃度，U/L；B_m——樣品反應(yīng)速率，min^-1；B₀——試劑空白速率，min^-1；ε——NADH在340nm下的摩爾吸光系數(shù)，m²mol^-1；V_R1——反應(yīng)試劑體積，2.00mL；V_R2——啟動(dòng)試劑體積，0.20mL；V_s——樣品體積，0.20mL；V_Res——樣品復(fù)溶體積，mL；L_m——實(shí)驗(yàn)比色皿實(shí)際光徑，mm。
    設(shè)，V=V₁+V₂+1，則最終得到測(cè)量的數(shù)學(xué)模型為
    
    式中:ε為常數(shù)，其不確定度可忽略。因此，V_Res、L_m、V、B這4個(gè)輸入量的不確定度是測(cè)定結(jié)果C的主要不確定度來(lái)源。

　　2.評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量
　　(1)樣品復(fù)溶體積(V_Res)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_VRes
    采用稱重法確定樣品復(fù)溶體積，數(shù)學(xué)模型為
    
    則有:
    
    因皮重mt與毛重mg是由同一臺(tái)天平測(cè)量的，所以二者相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)r為-1。由此得到:
    u²_(mg-mt)=u²_mg+u²_mt+2ru_mgu_mt
    u²_mg=u²_mt=u²_天平=u²_偏載+u²_示值+u²_重復(fù)
    u²(mg-mt)=(u_mg+u_mt)²=(2u_天平)²
    水溫為23.86℃，因本實(shí)驗(yàn)室溫度計(jì)的最大允許誤差為±0.02℃，故測(cè)溫誤差對(duì)水密度的影響可忽略，水密度ρ的不確定度主要源于密度值本身的擴(kuò)展不確定度，本文為5×10^-3kg/m³(k=2)。表1列出了復(fù)溶體積不確定度評(píng)定時(shí)的相關(guān)數(shù)據(jù)。

表1  復(fù)溶體積不確定度評(píng)定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量評(píng)定一覽表

　　注:根據(jù)JJG1036-2008《電子天平》檢定規(guī)程中所規(guī)定的天平重復(fù)性檢定方法，天平重復(fù)性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差按極差方法計(jì)算。本次測(cè)得數(shù)據(jù)的極差為0.05mg，測(cè)量6次，所以n=6，查表得d_n值為2.53，計(jì)算出由重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定為1.98×10^-2mg。
    將數(shù)據(jù)代入式(3)，可得出樣品復(fù)溶體積:
    V_Res=4.995mL
    將數(shù)據(jù)代入式(4)，則有
    

　　(2)實(shí)驗(yàn)皿光徑修正(L_m)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_Lm
　　在標(biāo)準(zhǔn)皿與實(shí)驗(yàn)皿中分別加入440nm下吸光度約為0.45的重鉻酸鉀溶液2.00mL，測(cè)定440nm處的吸光度，計(jì)算得出實(shí)驗(yàn)皿的實(shí)際光徑。計(jì)算公式為
    
    式中:L_m——實(shí)驗(yàn)皿光徑；A_m、A_s——實(shí)驗(yàn)皿與標(biāo)準(zhǔn)皿吸光度；L_s——標(biāo)準(zhǔn)皿光徑。
    光徑修正不確定度主要源于光度計(jì)的透射比準(zhǔn)確度與標(biāo)準(zhǔn)皿光徑值的不確定度。當(dāng)透射比讀數(shù)誤差為1%時(shí)，所引起的測(cè)定結(jié)果相對(duì)誤差()約為3%。檢定報(bào)告中給出的光度計(jì)的透射比誤差為0.2%，所引起的測(cè)定結(jié)果相對(duì)誤差為0.6%。由證書得知，標(biāo)準(zhǔn)皿光徑值的擴(kuò)展不確定度為U=(1+L_S/100)，k=2。表2中列出了光徑修正不確定度評(píng)定的有關(guān)數(shù)據(jù)。

表2  光徑修正不確定度評(píng)定的相關(guān)數(shù)據(jù)

　　將表2中的數(shù)據(jù)代入下式則得到光徑修正的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
    

　　(3)反應(yīng)速率(B)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_B
　　在180s內(nèi)每20s讀取一次吸光度，所得數(shù)據(jù)采用最小二乘法，以時(shí)間(min)為自變量、吸光度為因變量得出回歸方程，斜率b的值即為反應(yīng)速率值，因此，u_B中包含了b的不確定度。溫度T對(duì)B的影響也是不能忽略的，通常T每升高10℃，B增加0.5～1.5倍，本例取中間值1.0。由于參考方法要求T的擴(kuò)展不確定度為0.1℃(k=2)，則相應(yīng)的反應(yīng)速率變化為1%。
    B的數(shù)學(xué)模型為
    
    式中:A——吸光度；t——監(jiān)測(cè)時(shí)間；a——回歸方程的截距；b——斜率。
    表3中列出斜率b的標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)估相關(guān)數(shù)據(jù)(以一次測(cè)定為例)。

表3  斜率b的標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)估相關(guān)數(shù)據(jù)

　　兩次試劑空白速率的標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方分別為(原始數(shù)據(jù)從略):
    u²_B01=u²_b01+u²T₀₁=2.69×10^-8+1.67×10^-10=2.71×10^-8min^-2
    u²_B02=u²_b02+u²_T02=3.94×10^-8+1.35×10^-10=3.95×10^-8min^-2
    代入式(5)，可得出反應(yīng)速率的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
    

　　(4)加樣體積(V)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_V
　　由式(2)可知，加樣體積V的數(shù)學(xué)模型為
    V=V₁+V₂+1
    因有:
    故V₁與V₂間是相關(guān)的，在進(jìn)行方差合成時(shí)需計(jì)算兩者的協(xié)方差，公式為
    
    實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由EPPENDORF加樣槍加注樣品0.20mL(V_s)，由HAMILTON稀釋分配器1號(hào)與2號(hào)分別加注反應(yīng)試劑2.00mL(V_R1)與啟動(dòng)試劑0.20mL(V_R2)。實(shí)驗(yàn)室用稱重法對(duì)加樣裝置的準(zhǔn)確性與精密度進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)次數(shù)n為10，稱量均值為，加樣重復(fù)性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差為SD。則數(shù)學(xué)模型為
    
    由于已考慮了加樣重復(fù)性，在天平稱量不確定度中可以不考慮天平重復(fù)性，因此
    u²_天平=u²_偏載+u²_示值
    表4與表5中列出了加樣體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)估的相關(guān)數(shù)據(jù)，部分?jǐn)?shù)據(jù)可參考表1。

 表4  加樣體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)估相關(guān)數(shù)據(jù)    

 表5  重復(fù)測(cè)定結(jié)果及相應(yīng)的不確定度評(píng)估參數(shù)

    由表4中的數(shù)據(jù)可計(jì)算得出:
    

　　3.計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度
　　由式(2)得出ALT活性濃度C的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
    
    將前述各值代入式(6)中，得
    

　　4.計(jì)算擴(kuò)展不確定度
　　取包含因子為2，則本例ALT濃度及其擴(kuò)展不確定度為
　　C=199.6U/L，U_C=3.2U/L(k=2)

　　5.重復(fù)測(cè)定結(jié)果的不確定度評(píng)估
　　對(duì)于在重復(fù)性條件下進(jìn)行多次測(cè)定的結(jié)果，其總體均值的不確定度評(píng)估應(yīng)包括單一結(jié)果的不確定度及多次測(cè)定的重復(fù)性。在進(jìn)行不確定度評(píng)估之前應(yīng)先進(jìn)行異常值檢驗(yàn)，將異常值剔除后再進(jìn)行評(píng)估。異常值檢驗(yàn)可使用Grubbs法或Dixon法。
    總體均值的計(jì)算公式為，則有
    
    表5中為重復(fù)測(cè)定10次的ALT濃度(已進(jìn)行異常值檢驗(yàn))及相應(yīng)的不確定度評(píng)估參數(shù)。
    將數(shù)據(jù)代入式(7)，得出:
    取包含因子為2，則重復(fù)性條件下ALT測(cè)定均值及其擴(kuò)展不確定度為
    

　　三、結(jié)論

　　在對(duì)ALT活性濃度進(jìn)行不確定度評(píng)估時(shí)，如測(cè)量數(shù)學(xué)模型中輸入量間是乘積關(guān)系，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量可以采用相對(duì)方差合成的方式計(jì)算，不需求出靈敏系數(shù)；當(dāng)數(shù)學(xué)模型不完全是乘積關(guān)系時(shí)，就不能采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成的方式計(jì)算，此時(shí)必須計(jì)算靈敏系數(shù)，才能將輸入量的不確定度轉(zhuǎn)化為輸出量的不確定度。本例中在被測(cè)量C的函數(shù)關(guān)系式中，原來(lái)輸入量之間不完全是相乘的關(guān)系，經(jīng)過(guò)變換，數(shù)學(xué)模型中輸出量轉(zhuǎn)化為4個(gè)輸入量的乘積。這樣就使最終合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)定簡(jiǎn)單方便了。

　　當(dāng)輸入量間相關(guān)時(shí)，要考慮相關(guān)系數(shù)。在進(jìn)行本例中的樣品復(fù)溶體積(V_Res)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定時(shí)，由于皮重mt與毛重mg是用同一臺(tái)天平測(cè)量的，因此它們間是相關(guān)的，相關(guān)系數(shù)r為-1。同樣在評(píng)定加樣體積(V)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)，由于V₁與V₂間是相關(guān)的，在進(jìn)行方差合成時(shí)計(jì)算了兩者的協(xié)方差。
    本文中所描述的評(píng)估模式是基于本實(shí)驗(yàn)室ALT測(cè)定程序及儀器狀況的，其他實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行此類評(píng)估時(shí)，應(yīng)先根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)程序及硬件等情況確定數(shù)學(xué)模型與不確定度來(lái)源后再進(jìn)行評(píng)定。